Desianty Dona Normalisa Sirait (POPT Ahli Muda)

Trichoderma viride merupakan salah satu jenis jamur yang hampir ditemukan di semua jenis tanah dan merupakan jamur yang paling umum dan dapat dibudidayakan. Jamur ini telah menunjukkan kekhususan inang yang sedikit, mengkolonisasi sebagian besar tanaman, dipelajari secara luas dan paling umum digunakan sebagai agen pengendali hayati di bidang pertanian. Produk jamur ini dimanfaatkan sebagai alternatif dari insektisida kimia.
Dalam lima belas tahun terakhir banyak ilmuwan mengadopsi metode yang berbeda untuk mempreservasi jamur dengan tujuan meningkatkan peluang hidup yang lama tetapi penyimpanan yang aman dari banyak strain jamur industri sangat penting untuk studi molekuler masa depan. Di antara beberapa pendekatan yang diketahui, penyimpanan mikroorganisme pada suhu rendah dalam bentuk beku memiliki beberapa keunggulan karena pembekuan meningkatkan umur simpan mikroorganisme tetapi pembekuan dan pencairan lagi dapat menurunkan viabilitas. Beberapa metode preservasi yang hemat biaya dan hasilnya bagus adalah di dalam air suling dan gel silika, tetapi tidak ada yang terbaik untuk jangka waktu yang lama/permanen. Durasi penyimpanan maksimum bervariasi antara 8-10 tahun dengan menggunakan metode preservasi khusus dan tergantung jenis mikroorganisme yang dipreservasi. Preservasi permanen sangat penting untuk strain dengan karakteristik yang sangat penting dan untuk jenis spesimen.
Memelihara dan mempertahankan kultur jamur sangat penting untuk studi sistematis dan keanekaragaman hayati. Karena jamur adalah seperti kelompok mikroorganisme yang beragam dan beberapa metode untuk budidaya dan penyimpanan. Metode murah dan tahan lama juga harus dipertimbangkan dalam preservasi kultur jamur. Koleksi kultur sangat mahal karena peralatan khusus dan perhatian terus menerus diperlukan untuk memelihara kultur jamur tanpa kehilangan keefektifan atau virulensinya karena selain jamur memiliki tingkat produksi yang tinggi, tetapi juga tingkat mutasi yang tinggi dengan berlalunya waktu sehingga para ilmuwan lebih tertarik untuk mempertahankan banyak strain yang penting dan strain industri.
Iqbal, et al (2017) mengevaluasi beberapa metode preservasi untuk menetapkan metode preservasi yang sederhana dan andal untuk pemeliharaan jangka panjang strain Trichoderma viride yang diisolasi dari tanah. Adapun beberapa metode preservasi Trichoderma viride pada kultur Potato Dextrose Agar (PDA) yang dilakukan adalah sebagai berikut:
1. Preservasi dengan transfer bertingkat
Sebagian besar kultur jamur dapat dipertahankan untuk beberapa periode dengan transfer bertingkat. Ada dua metode preservasi untuk transfer bertingkat untuk jangka pendek.
1.1. Preservasi kultur segar
Teknik spora tunggal digunakan untuk memperoleh kultur murni Trichoderma viride, dari kultur induk satu potong media diambil dan ditempatkan pada media baru. Dibungkus dengan baik dan diinkubasi pada suhu 25oC selama 7 hari dan diulangi setelah 15-20 hari untuk mempertahankan kultur dalam jangka waktu yang lebih lama.
1.2. Preservasi pada agar miring
Media PDA diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit pada tekanan 15 psi. Media yang diautoklaf dituang ke dalam tabung rekasi/botol yang sudah disterilkan. Media dibiarkan memadat dalam tabung reaksi/botol pada sudut 650. Sepotong lingkaran kecil inokulum Trichoderma viride dipindahkan ke PDA miring, tabung disimpan dalam inkubator pada suhu 25oC selama 7 hari dan dipertahankan pada suhu 4oC sebagai kultur murni.
2. Preservasi dalam air
Ada dua metode preservasi Trichoderma viride dalam air suling pada suhu kamar.
2.1. Suspensi spora
Air suling 1 ml yang disterilkan diautoklaf ditambahkan sepenuhnya untuk menumbuhkan kultur induk baru Trichoderma viride dan dikerok dengan spatula untuk menghasilkan bubur dan kemudian dipindahkan ke air suling 99 ml untuk membuat suspensi. Diambil 1000 l dalam sebuah botol kaca steril / tabung eppendorf, tutup dikencangkan dan simpan pada suhu kamar.
2.2. Potongan PDA dalam air suling
Air suling 3 ml yang diautoklaf diambil dalam botol kecil. Sepotong lingkaran kecil Trichoderma viride dari kultur baru diambil dan ditempatkan di botol berisi air suling dan disimpan di suhu kamar. Ini adalah metode lain yang murah dan perawatannya mudah untuk menyimpan kultur jamur selama 6 bulan sampai 1 tahun tanpa terkontaminasi.
3. Preservasi metode kering/suhu tinggi
Pada suhu tinggi maksimum jamur tertentu dapat dilestarikan. Ada banyak metode yang sebelumnya digunakan oleh ilmuwan untuk banyak jamur lainnya.
3.1. Panen langsung kultur segar
Setelah sporulasi komplit Trichoderma viride dari kultur induk dipanen dengan bantuan spatula kecil logam steril di atas kertas saring yang sudah diautoklaf. Konidia dipanen dikeringkan di udara selama dua hari di bawah aliran udara laminar dan disimpan dalam botol kecil bertutup ulir yang kedap udara (tinggi 10 cm, diameter 2,5 cm) pada suhu kamar atau di lemari es pada suhu 4 °C.
3.2. Preservasi pada tusuk gigi/serpih kayu
Tusuk gigi 50 buah dicelupkan ke dalam kaldu PDA 2% dan disterilkan selama 20 menit pada suhu 121°C. Setelah itu semua tusuk gigi dikeringkan dan ditempatkan pada kultur Trichoderma viride baru di dalam PDA. Disegel dengan parafilm dan diinkubasi pada suhu 25oC selama 5 hari untuk memungkinkan Trichoderma viride untuk mengkoloni tusuk gigi. Setelah 10-15 hari, serpihan kayu yang diinokulasi dipindahkan ke tabung reaksi steril (18 × 180 mm). Tabung disimpan pada suhu 4°C.
3.3. Metode strip agar
Kultur Trichoderma viride ditanam di cawan petri berisi media PDA. Strip sepanjang 1 cm dipotong dari kultur induk dan ditempatkan dalam cawan petri steril, inkubasi pada suhu kamar selama 1-1,5 minggu. Media agar menjadi kering dan pindahkan strip kering ini ke dalam botol terpisah dan disegel.
3.4. Preservasi di pasir
Pasir sebanyak 5 gram diambil dalam botol disterilkan pada suhu 121oC selama 15 menit dan dijaga tingkat kelembaban 20%. Botol-botol itu dibiarkan dingin kemudian disterilkan kembali. 5 ml air suling disterilkan ditambahkan dalam kultur induk baru Trichoderma viride, dan dikikis dengan lembut untuk menghasilkan suspensi spora. Satu mililiter suspensi ditambahkan ke setiap botol pasir steril. Setelah 2-14 hari pertumbuhan di suhu ruang dan disimpan dalam lemari es pada suhu 4°C.
3.5. Preservasi pada kertas saring
Kertas saring dan potong kecil-kecil diautoklaf; potongan kertas saring ini diatur dalam cawan berisi media PDA. Serumpun kecil miselium Trichoderma viride ditempatkan pada setiap lembar kertas saring. Bungkus cawan petri dengan baik menggunakan parafilm, dan diinkubasi pada suhu 25oC selama 8 hari karena jamur tumbuh perlahan di atas kertas saring. Setelah jamur mulai bersporulasi pada kertas saring, masing-masing bagian kertas saring yang diselimuti kultur jamur dipisahkan satu sama lain dan ditempatkan di cawan petri baru tanpa media PDA/piring kosong. Setelah itu cawan petri ditempatkan lagi ke dalam inkubator selama 30 hari sampai kertas saring dan jamur benar-benar kering. Ketika jamur dikeringkan sepenuhnya; kertas saring mengandung kultur Trichoderma viride ini disegel dengan benar dalam kantong risleting berukuran kecil. Beri label dengan benar dan simpan pada suhu 4oC.
4. Preservasi pada suhu rendah
Banyak kultur jamur dapat dilestarikan pada suhu rendah, untuk menonaktifkan metabolisme mereka untuk jangka waktu pendek dan panjang.
4.1. Pembekuan dalam nitrogen cair
Diambil 1 ml larutan steril gliserol 10% ke tabung eppendorf. Potongan kecil berdiameter 2 mm dipotong dari kultur induk Trichoderma viridee yang segar dan tumbuh kuat dengan menggunakan pisau bedah yang disterilkan. Beberapa potongan ditempatkan dalam botol, tutupnya dikencangkan dengan parafilm dan tabung ditempatkan langsung ke dalam tangki nitrogen cair selama lebih dari 2 tahun.
4.2. Pembekuan kultur secara langsung
Kultur yang ditanam pada agar miring dalam botol atau tabung reaksi dengan tutup sekrup ditempatkan langsung di dalam freezer. Kultur berhasil dipreservasi pada suhu -80 ° C hingga 2 tahun. Secara umum, strain yang kuat dapat tetap bersporulasi lebih baik meskipun setelah proses pembekuan daripada strain yang kurang kuat. Tidak direkomendasikan pembekuan dan pencairan berulang, yang secara nyata akan mengurangi viabilitas. Morfologi dan fisiologi Trichoderma viride dapat berubah karena pencairan dan pelelehan secara terus menerus.
5. Metode mati lemas
Dalam metode ini kultur jamur dipreservasi dengan membuat kondisi anaerobik agar jamur tidak bersporulasi.
5.1. Preservasi di susu bubuk dan gel silika
Susu bubuk 3,5 g dicampur dengan 50 ml air deionisasi dan disterilkan dengan cara direbus selama 20 menit. Juga dapat menggunakan susu kental bukan susu bubuk. Sterilisasi di autoklaf pada tekanan 15 psi selama 20 menit harus dihindari karena akannmengkarmelisasi susu. Tabung tutup ulir diisi setengahnya dengan silika gel ukuran mesh 6-22. Suspensi spora Trichoderma viride disiapkan dalam 10 ml susu, yang sebelumnya didinginkan pada suhu 4°C. Gel silika juga didinginkan pada suhu 4°C. \suspensi spora 100 μl ditambahkan untuk membasahi sekitar tiga perempat dari gel silika dan dibiarkan selama 30 menit. Tabung disimpan pada suhu kamar selama 1-2 minggu.
5.2. Menutupi dengan tetes minyak
Kultur Trichoderma viride ditanam miring; minyak sayur 10 ul dituangkan di atas kultur jamur dan benar-benar terendam minyak. Metode ini berbiaya dan perawatan rendah untuk mempreservasi kultur di media miring. Kultur bisa dipertahankan selama bertahun-tahun dan salah satu keuntungan utamanya adalah terhindar dari serangan tungau.
Viabilitas dan kemurnian isolat segera diamati dan dievaluasi setelah 3 bulan, 6 bulan, 9 bulan, 12 bulan, 15 bulan, 18 bulan, 21 bulan dan setelah 24 bulan penyimpanan selanjutnya seperti yang ditunjukkan pada tabel 1. Jamur yang disubkultur dievaluasi berdasarkan apakah mereka tumbuh setelah penyimpanan yang berbeda pada interval waktu tertentu dan mempertahankan ciri morfologi aslinya.
Tabel 1. Persentase pemulihan Trichoderma viride dengan berlalunya waktu
dengan mengadopsi metode preservasi yang berbeda
Metode preservasi Viabilitas (%) dalam waktu (bulan)
3 6 9 12 15 18 21 24
Kultur segar 100 100 100 90 90 60 30 10
Kultur miring 100
Suspensi spora 100 80 20 0 0 0 0 0
Potongan kultur dalam air suling 100 90 50 10 0 0
Panen langsung dari kultur (kontrol) 100 100 100 100 100 100 90 90
Tusuk gigi/ keping kayu 100 100 90 80 70 30 0 0
Strip agar 100 100 100 60 37 20 0 0
Preservasi pasir 100 100 100 90 90 85 80 50
Preservasi kertas saring 100 100 100 100 100 90 90 85
Pembekuan dalam nitrogen cair 100 100 80 50 20 0 0 0
Pembekuan langsung kultur 80 50 0 0 0 0 0 0
Susu skim 50 20 3 1 0 0 0 0
Tetesan minyak diatas kultur 70 68 42 14 10 5 0 0
Sumber: Iqbal et al, 2017.
Kriopreservasi dalam nitrogen cair dan liofilisasi adalah metode yang direkomendasikan dan digunakan oleh Koleksi Kultur Tipe Amerika. Preservasi nitrogen cair lebih mahal, jadi tidak ada yang mampu membeli nitrogen cair dalam besar jumlah. Penyimpanan jamur dalam nitrogen cair adalah cara yang efektif untuk preservasi yang tidak dapat diliofilisasi. Biayanya agak lebih mahal dari liofilisasi. Penyimpanan nitrogen cair direkomendasikan untuk preservasi dictyostelids dan amuba. Keuntungan utama dari penyimpanan nitrogen cair termasuk pencegahan peningkatan variabilitas genetik kultur; menghemat waktu, mengurangi tenaga kerja, pencegahan hilangnya kultur karena kontaminasi; dan meningkatnya jaminan ketersediaan kultur jangka panjang. Berbagai teknik alternatif untuk penyimpanan nitrogen cair, seperti: menggunakan sedotan plastik sebagai pengganti vial atau tabung, telah dilaporkan.
Preservasi pada kultur segar dan miring itu sederhana, murah, dan luas digunakan. Meskipun memakan waktu dan tenaga. Ini metode yang baik ketika harus memelihara satu atau dua isolat dan terus-menerus digunakan untuk waktu yang singkat (kurang dari 1 tahun). Tetapi metode ini juga memiliki beberapa kelemahan, kontaminasi oleh tungau dan lainnya adalah pengeringan/kematian sel sebelum digunakan di masa yang akan datang. Selain itu, morfologi dan fisiologi jamur yang dibudidayakan dapat berubah dari waktu ke waktu.
Tingkat kelembaban 10% sangat baik untuk penyimpanan jangka panjang Trichoderma viride pada suhu kamar. Kultur bisa tetap layak selama lebih dari 10 tahun tanpa mengubah morfologi dan fisiologinya.
Kultur serpihan kayu / tusuk gigi adalah yang terbaik untuk jamur kayu, karena Trichoderma juga menginfeksi atau ada di permukaan pohon dan dapat dengan mudah diisolasi dari batangnya.
Metode strip agar juga sangat murah dan dapat diandalkan untuk preservasi kultur Trichoderma viride, Pythium, Rhizoctonia, dan beberapa spesies Basidiomycetes dapat bertahan 18 bulan dengan metode ini, sedangkan ascomycetes dan bentuk mitosporik dapat bertahan dari 3-5 tahun.
Metode susu bubuk tidak sesuai dengan Trichoderma viride, warna spora berubah total dan juga banyak kontaminasi bakteri selama pemulihan. Setelah tiga bulan peneliti hanya mendapatkan koloni bakteri, bukan kultur Trichoderma. Jadi ini bukan metode yang baik untuk preservasi karena Trichoderma viride menghasilkan enzim dan antibiotik yang bereaksi dengan laktosa susu yang mendukung pertumbuhan jamur.
Metode kertas saring adalah teknik baru yang tidak hanya dapat diandalkan; tetapi juga sangat murah dan mudah digunakan di laboratorium mana pun dengan sedikit sumber daya. Tidak ada penurunan viabilitas yang dapat dideteksi dari setiap strain jamur.

Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian Iqbal et al (2017) adalah sebagai berikut:
1. Preservasi pada pasir, kertas saring, metode kering dan air suling terbukti menjadi yang terbaik karena setelah disimpan selama 12 bulan masih memiliki viabilitas yang baik yaitu 80-100%.
2. Semua dari hasil di atas menunjukkan bahwa Trichoderma viride dapat bertahan dalam bentuk kering/ bentuk tidak aktif selama lebih dari 2 tahun yaitu dengan kertas saring tetapi tahapan pengeringan adalah yang paling penting karena jika pengeringan dilakukan terlalu cepat, jamur bisa kehilangan efikasi/patogenitasnya yang bisa menyebabkan kematian spora jamur pengendali hayati. Apabila pengeringan dilakukan terlalu lambat maka dapat terkontaminasi oleh jamur atau bakteri lain.
3. Untuk preservasi kultur dalam air yang dihidupkan kembali setelah 12 bulan tidak menyebabkan kehilangan efikasinya.

Disadur dari:
Iqbal, S. M. Ashfaq, A.H. Malik, Inam-Ulhaq, K.S. Khan and P. Mathews. 2017. Isolation, preservation and revival of Trichoderma viride in culture media. In Joernal of Entomology and Zoology Studies. 5(3):1640-1646.